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Universitätsklinikum Regensburg - Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde, Experimentelle Ophthalmologie

M. Sc. Nicole Schäfer

Thema: "Funktion von FHR-1 und FHR-3 bei der altersabhängigen Makuladegeneration - ein Antikörper-basierter Ansatz"

Beginn der Förderung: 01.01.2018
Dauer der Förderung: 12 Monate
Höhe der Fördersumme: 15.600 €

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Der häufigste Grund für eine irreversible Visusbeeinträchtigung bis hin zur Erblindung im Alter ist die altersabhängige Makuladegeneration (AMD). Effektive Therapieoptionen, basierend auf monoklonalen Antikörpern, sind derzeit nur für die Behandlung der neovaskulären Form der AMD (feuchte AMD) verfügbar. Eine wirksame Therapie für die atrophische Variante (trockene AMD) wird von den Betroffenen seit vielen Jahren dringend erwartet.

Eine Fehlregulation des Immunsystems, v.a. des Komplementsystems, gilt als ein wesentlicher Risikofaktor für die Entstehung der AMD. Es ist seit mehr als einer Dekade bekannt, dass genetische Veränderungen in den Komplementregulatoren Faktor H (cfh) und den cfh-verwandten Genen cfhr1 und cfhr3 mit der AMD-Pathogenese assoziiert sind. Ein Fehlen von cfhr3/cfhr1 impliziert einen protektiven Effekt für die AMD, der genaue Einfluss und die proteinbiologische Rolle der FHR-1 und FHR-3 Proteine auf die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung wurde bis jetzt nicht eindeutig aufgeklärt.

Das beantragte Projekt soll die Wirkung von spezifischen anti-FHR-1/-FHR-3 monoklonalen Antikörpern auf das systemische und lokale Komplementsystem an retinalen Pigmentepithelzellen untersuchen.

Unser Ziel ist es, die Funktionsaufklärung von FHR-1 und FHR-3, in Bezug auf die AMD-Pathogenese, bedeutend voranzutreiben und mit Hilfe der generierten Antikörper einen neuartigen lokalen Therapieansatz für die Bekämpfung retinaler Autoimmunerkrankungen zu liefern.

 


Universitätsklinikum Regensburg und Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde

Dr. med. Caroline Brandl

Prof. Dr. Iris Heid

Augenklinik Klinikum Augsburg Stenglinstr. 2 86156 Augsburg

Prof. Dr. med. Arthur Mueller

Thema: "Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) in jüngeren Personen - Langzeitbeobachtungen in der populationsbasierten KORA Studie"

Beginn der Förderung: 01.08.2017
Dauer der Förderung: 24 Monate
Höhe der Fördersumme: 25.100 €

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für irreversiblen Visusverlust in der älteren Bevölkerung von Industrieländern.

[1] Obwohl die AMD gemeinhin als Erkrankung von über 50-Jährigen definiert wird, konnte unsere eigene Analyse eines Querschnitts der deutschen Gesamtbevölkerung[2] sowie eine vergleichbare Studie von Kollegen[3] belegen, dass auch deutlich jüngere Personen von Veränderungen betroffen sind, die Merkmale früher AMD gleichen. Hierfür haben wir Farbfundusaufnahmen der zentralen Retina von 2840 Probanden der Kooperativen Gesundheitsforschung in der Region Augsburg (KORA) Studie im Alter von 25-75 Jahren hinsichtlich AMD-Veränderungen befundet, ohne auf das Alter der Person Rücksicht zu nehmen. Diese Aufnahmen waren in den Jahren 1999-2001 generiert worden. Fast 40% der Teilnehmer mit AMD-Veränderungen waren jünger als 50 Jahre - ein möglicher Hinweis darauf, dass AMD als Erkrankung im jüngeren Alter unterschätzt wird.

[2] Allerdings ist bisher unklar, ob diese detektierten AMD-Veränderungen in den Jüngeren tatsächlich zu klinisch manifester später AMD führen. Derzeit gibt es weltweit insgesamt wenig - und in Deutschland keine - Langzeitbeobachtungen von unter 50-Jährigen hinsichtlich der Entwicklung einer späten AMD.

Unser Ziel ist deshalb herauszufinden, wie sich diese Fundusläsionen in den jüngeren Personen über die Zeit verändern und ob sie sich in ähnlicher Weise zu später AMD manifestieren, wie dies bei älteren Personen bekannt ist. Dazu gibt es jetzt eine passende Gelegenheit, da die KORA-Studienorganisatoren eine Folgeerhebung nach 17-18 Jahren ab Herbst 2017 durchführen werden, was ein Millionen-Euro-Unternehmen darstellt.

Gemeinsam mit den KORA-Organisatoren planen die AntragstellerInnen mit einem relativ kleinen finanziellen Aufwand, eine Augenuntersuchung in diese Folgeerhebung einzubauen. Dabei würden wir bei denjenigen Personen, die damals 35-55 Jahre und nun 53-73 Jahre alt sind, erneut Farbfundusbilder generieren. Somit könnten wir die Frage beantworten, ob es einen Zusammenhang gibt zwischen AMD-ähnlichen Veränderungen vor 18 Jahren und dem Auftreten von intermediärer oder später AMD jetzt.

Auch wenn derzeit effiziente Präventionsprogramme für AMD noch fehlen, wäre es essentiell zu verstehen, ob solche Programme nur für ältere oder eben auch für jüngere Personen in Betracht zu ziehen wären. Wenn man das Dogma, dass es sich bei der AMD um eine Erkrankung der Älteren handelt, überdenkt und Studien auf Jüngere ausweitet, ließe sich womöglich die Entstehung der späten AMD aus frühen AMD-Veränderungen besser verstehen. Dies kann für die Entwicklung von Präventions-und Therapieoptionen maßgeblich sein.

 


Universitätsaugenklinik Tübingen

 

Dr. rer. nat. José Hurst
Dr. rer. Nat. Sven Schnichels

Thema: "Evaluation der neuroprotektiven Wirkung des Lipid-modifizierten BDNF/TrkB-Aptamer"

Beginn der Förderung: 01.06.2017
Dauer der Förderung: 12 Monate
Höhe der Fördersumme: 36.700 €

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Degenerationsprozesse der Retina, wie sie unter anderem bei der altersbedingten Makuladegenera-tion (AMD) oder der Retinitis Pigmentosa (RP) auftreten, resultieren meist in der Apoptose von Pho-torezeptoren und können bis zur Erblindung führen. Die Wachstumsfaktor-basierte Therapie ist ein vielfach untersuchter Ansatz, um eine Verlangsamung oder den Stillstand der Sehzelldegeneration zu erzielen.

BDNF ist ein vielversprechender neurotropher Wachstumsfaktor, der seine Wirkung über die Aktivierung der TrkB-Signalkaskade entfaltet. Durch Einsatz eines bereits publizierten Aptamers, welches spezifisch an den TrkB-Rezeptor bindet, wollen wir den neuroprotektiven Effekt von BDNF imitieren und eine neue Therapieoption für retinale Erkrankungen entwickeln. TrkB Aktivierung mit dem Aptamer adressiert spezifisch die gewünschten Zellen und reduziert somit Nebenwirkungen, die bei der BDNF Therapie auftreten können. Zur Erhöhung der Adhäsion ist die Modifizierung des Apta-mers mittels Lipidsträngen vorgesehen. Die dadurch entstehende Effizienzsteigerung konnten wir bereits in einigen Vorversuchen zeigen. In einem ersten Schritt soll die Unbedenklichkeit des TrKB-Aptamers an retinalen Zellen und im Organmodell bestätigt werden. Zudem werden die Verweildau-er und die Bindungseffizienz ebenfalls in Zellkultur und an Retinaexplantaten überprüft. Der neu-roprotektive Effekt der Aptamere wird anschließend an einem von uns etablierten, auf CoCl2 basie-renden, retinalen Schädigungsmodell getestet. Dafür werden histologische Untersuchungen, moleku-larbiologische Messungen zur Überlebensrate der Photorezeptorzellen und OCT-Verfahren zur Be-stimmung der Schichtdicke der Netzhaut sowie ERG-Messungen zur Funktionalität durchgeführt.

Ziel ist es erste Daten über eine neuartige Therapieoption zur Behandlung retinaler Degenerationser-krankungen zu generieren, um damit einen DFG-Antrag zur weiteren Untersuchung zu stellen.

 


 

Institut für Humangenetik Universitätsklinikum zu Köln

Prof. Dr. med. Hanno Bolz

Thema: "Identifizierung neuer Krankheitsgene für isolierte und syndromale Retinopathien"

Beginn der Förderung: 01.06.2017
Dauer der Förderung: 1 bis 2 Jahre
Höhe der Fördersumme: 30.625 €

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Ziel ist die Identifizierung neuer Gene für autosomal-rezessiv erbliche isolierte und syndromale Retinadystrophien (RD). Konsanguine Familien (Eltern Betroffener sind verwandt) sind hierfür besonders geeignet. Es werden zwei Schritte durchgeführt:

1.       Aus 50 Familien wird ein Patient durch Exom-Sequenzierung (WES) untersucht, eine Form von next-generation sequencing (NGS), bei der die proteinkodierenden Teile (Exons) aller Gene analysiert werden. Patienten werden keine Mutation eines bekannten RD-Gens, sondern wahrscheinlich eine (im WES mit erfaßte) Mutation in einem „neuen“ RD-Gen aufweisen, die homozygot ist (gleiche Mutation auf beiden Genkopien).

2. Mitunter läßt sich die Mutation in einem neuen RD-Gen im WES schnell erkennen (z.B. homozygote Stoppmutation in einem retinalen Gen). Oft ist man aber mit vielen seltenen Varianten konfrontiert. Hilfreich ist hier eine genomweite Kopplungsanalyse mit Proben weiterer Familienmitglieder zur Identifikation chromosomaler Kandidatenregionen. Diese stellen einen Filter dar – es kommt dann nur noch ein Bruchteil der im WES gefundenen Varianten als RD-verursachende Mutation in Frage.

Die Identifizierung neuer Krankheitsgene ist vor allem relevant für

• Diagnostik und Beratung: Neue Gene finden heute schnell Eingang in die NGS-basierte Routinediagnostik, was eine Sicherung bzw. Präzisierung der Diagnose und eine Einschätzung von Wiederholungswahrscheinlichkeiten (genetische Beratung!) gestattet.

• Therapieansätze: Gentherapie-Ansätze für verschiedene RD-Gene sind in klinischen Studien oder kurz davor. Neue RD-Gene stellen somit potentielle Ziele für Therapien dar.

 


Experimentelle Ophthalmologie Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde Gießen

Prof. Dr. Dr. Knut Stieger

Thema: „Die biosensorbasierte VEGF Konzentrationsmessung als erster Schritt zu einer personalisierten Medizin bei altersabhängiger Makuladegeneration (AMD)"

Beginn der Förderung: 01.04.2017
Dauer der Förderung: 12 Monate
Höhe der Fördersumme: 15.600 €

Zusammenfassung des Projektes: 

Die Prävalenz der altersabhängigen Makuladegeneration nimmt in der zunehmend älter werdenden Bevölkerung rapide zu. Zur Behandlung werden erfolgreich synthetische Moleküle mit hemmender Aktivität gegenüber dem vascular endothelial growth factor (VEGF) eingesetzt. Aufgrund der kurzen Halbwertzeit müssen diese Moleküle jedoch regelmäßig über eine lange Zeitdauer intraokular appliziert werden. Eine solche Behandlung ist mit erheblichen Risiken für die Patienten verbunden und stellt das Gesundheitswesen vor enorme Kosten. Optimierungen des Behandlungsschemas sind aufgrund von mangelnden diagnostischen Methoden zur VEGF Quantifizierung im Auge schwierig.

Ziel des Gesamtprojektes ist die Entwicklung eines Biosensors, der die VEGF Konzentrationsmessung im Auge nicht-invasiv ermöglicht.

Im Rahmen dieses Antrages soll der bereits im Entwicklungsstadium befindliche Biosensor weiter optimiert und auf der Zelloberfläche einer Zelllinie stabil exprimiert werden. Der Biosensor basiert auf der bioluminescence resonanse energy tranfer (BRET) Technologie, bei der durch veränderte Interaktion zweier fluoreszierender Moleküle die Konzentration eines dritten Moleküls (hier VEGF) berechnet werden kann. Die VEGF Bindungseigenschaften des vorhandenen Moleküls sollen durch Austausch von Linkersequenzen oder VEGF Bindungsdomänen verbessert werden.

Zur Herstellung der Zelllinie, die den Biosensor stabil exprimiert und auf der Zelloberfläche trägt, wird bei arpe19 Zellen das VEGF Gen durch CRISPR-Cas vermitteltes genome editing ausgeknockt, die Proretina Projektantrag Stieger - VEGF Biosensor 2.0 Expressionskassette stabil transfiziert und der Biosensor analog zu „chimären Antigen-Rezeptoren" auf T-Zellen (CARs) auf der Oberfläche verlinkt. Die Arbeiten in dem beantragten Projekt stellen als Abschluss des Promotionsprojektes von Herrn Wimmer die Grundlage für einen momentan in der Bearbeitung befindlichen Antrag bei BMBF dar, in dem ein Prototyp des Biosensors für den Einsatz im Auge entwickelt werden soll.

 


Universität Tübingen - Forschungsinstitut für Augenheilkunde / Dr. Francois Paquet-Durant & Soumyaparna Das

Thema: "Targetierung der CNG-Ca2+ Kanäle: Evaluation von pharmakologischen und genetischen´knock-down´ Ansätzen zur Behandlung der Retinitis Pigmentosa"

Antragskategorie: Promotionsstipendium
Beginn der Förderung: 01.08.2016
Dauer der Förderung: 12 Monate
Höhe der Fördersumme: 15.600 €

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Das Ziel dieser Studie ist es, dass neuroprotektive Potential von pharmakologischen Substanzen und genetischen Methoden (Oligonukleotid-vermittelter knock-down), die den sogenannten cyclic nucleotide gated Ca2+ Kanal (CNG Kanal) targetieren, im Kontext der Photorezeptordegeneration bei Retinitis Pigmentosa (RP) zu evaluieren.

Die Studie ist aufgeteilt in einen in vitro Screening und Validierungsanteil in den ersten beiden Projektjahren und soll dann mit einem in vivo Testanteil in relevanten RP Tiermodellen (rd1, rd2, und rd10 Mäusen) im dritten Jahr fortgesetzt werden.

Zu Beginn wird der Effekt von verschiedenen Substanzen und Oligonukleotiden auf den CNG Kanal in organotypischen Netzhautexplantatkulturen in vitro getestet, um rasch das Konzept zu validieren und entsprechende Dosis-Wirkungskurven aufnehmen zu können. Diese Versuche werden ergänzt durch Calcium-imaging Experimente auf Netzhaut-Präparationen von RP Tiermodellen, um die Effizienz und Auswirkung auf den Photorezeptor-Calcium-Spiegel zu erfassen. Die vielversprechendste Substanz oder Oligonukleotid wird dann mit in vivo Versuchen weiter getestet werden, entweder nach systemischer (intraperitoneal) oder lokaler (intravitreal) Anwendung, in drei verschiedenen RP Tiermodellen. Dabei werden scanning laser ophthalmoscopy (SLO) und optic coherence tomography (OCT) in vivo imaging Techniken zum Einsatz kommen, um die Behandlungseffekte in longitudinalen Studien messen zu können. Dies wird kombiniert mit electroretinographischen (ERG) Funktionsmessungen.

Insgesamt soll das Studienprogramm feststellen ob die Targetierung des CNG-Kanals für die RP-Therapieentwicklung geeignet ist. Im Erfolgsfall könnte die Verfügbarkeit von bereits umfangreich getesteten CNG-Kanal Inhibitoren eine spätere klinische Translation in RP Patienten stark vereinfachen.

 


Center für regenerative Therapien Dresden / Prof. Dr. Marius Ader & Silvia Llonch

Thema:"Transplantation von Stammzell-abgeleiteten Zapfen zur Therapie retinaler Degeneration"

Antragskategorie:  Promotionsstipendium
Beginn der Förderung: 01.07.2016
Dauer der Förderung: 24 Monate (optional 36 Monate)
Höhe der Fördersumme: 31.200 € (optional 46.800 €)

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Die Netzhaut, welche als Fenster des zentralen Nervensystems zur Außenwelt betrachtet werden kann, liegt im hinteren Teil des Auges und ist für den Sehprozess verantwortlich. Sie besteht aus sieben intrinsischen Zelltypen, sechs neuronalen und einer glialen, welche in drei Kernschichten organisiert sind.

Die Hauptursache für Erblindung in industrialisierten Ländern ist der Verlust der lichtempfindlichen Zellen, den sogenannten Fotorezeptoren, welche sich in der äußeren Kernschicht der Netzhaut befinden. Derzeit werden verschiedene therapeutische Ansätze zur Behandlung von Retinopathien untersucht, wobei noch keiner dieser Ansätze eine bedeutende und andauernde Verbesserung des Sehvermögens ermöglichen.

Als alternative Behandlungsmöglichkeit wird der Austausch von Fotorezeptoren durch Zelltransplantation untersucht. Jüngste vor-klinische Studien zeigen, dass junge, primäre Fotorezeptoren in der Lage sind, sich nach der Transplantation zu integrieren und die Sehfunktion in adulten Netzhäuten von Mausmodellen mit verschiedenen Typen retinaler Degeneration wiederherzustellen. Zusätzlich ermöglicht die Generierung von transplantierbaren Fotorezeptoren aus stammzell-abgeleiteten Organoiden prinzipiell eine unbegrenzte Quelle an Spendermaterial, wobei gleichzeitig die Nutzung von Primärzellen aus fötalem Gewebe umgangen werden kann.

Ein Großteil der oben erwähnten Studien konzentrierte sich auf Stäbchen-Fotorezeptoren, weil diese 97% der Fotorezeptoren in der Retina von Nagetieren ausmachen. Im Gegensatz zur nachtaktiven Maus mit Stäbchen-dominiertem Sehvermögen, ist das menschliche Sehvermögen hauptsächlich auf Zapfen-Fotorezeptoren angewiesen, da diese Farberkennung und Sehschärfe unter Tageslichtbedingungen ermöglichen.

Das Ziel dieser Doktorarbeit besteht in der Generierung und Anreicherung von Zapfen-Fotorezeptoren in embryonalen Stammzell-abgeleiteten retinalen Organoiden und die Analyse hinsichtlich ihres therapeutischen Potentials für die Wiederherstellung des Sehvermögens in Mausmodellen starker retinaler Degeneration.

Der erste Schritt des Projektes ist die Generierung von mES zell-abgeleiteten retinalen Organoiden mit angereicherten Zapfen-Fotorezeptoren-Vorläufern und deren weitere Aufreinigung durch Zelloberflächenmarker. Um dieses Ziel zu erreichen, werden nmES Zelllinien, die einen retina-spezifischen (Rx-GFP) oder fotorezeptorspezifischen (Crx-GFP) GFP-Reporter exprimieren genutzt, um Protokolle zur Produktion retinaler Organoide in ausreichender Zahl und Qualität zu entwickeln.

Des Weiteren wird derzeit eine GFP_Reporter mES Zelllinie (Thrß2-GFP) entwickelt, die die direkte Identifizierung von jungen Zapfen in Retina-Organoiden erlaubt. In weiteren Experimenten wird in den retinalen Organoiden der Notch-Signalweg, von dem bekannt ist, dass er in die retinale Entwicklung involviert ist, mittels DAPT und/oder Anti-Notch1 Antikörpern im geeigneten Entwicklungsstadium inhibiert, um die sich teilenden retinalen Vorläuferzellen dazu zu zwingen, den Zellzyklus zum Zeitpunkt der Zapfengenerierung zu verlassen und damit den Anteil der Zapfen-Fotorezeptor-Vorläufern innerhalb der retinalen Organoiden zu erhöhen. Vor der Transplantation in Mausmodelle RETINALER Degeneration werden MACS (magnetic-activated cell sorting)genutzt, um die Zapfen-Fotorezeptoren innerhalb des Zelltransplantats anzureichern.

Das zweite Ziel besteht darin, die Zapfen-angereicherte Zellpopulation in verschiedene Mausmodelle mit zapfen- bzw. vollständiger ONL Degeneration zu transplantieren. Danach erfolgt die Analyse hinsichtlich Überleben, Reifung und Funktionalität der Spenderzellen. Um dieses Ziel zu erreichen, werden die Versuchstiere mittels verschiedener Techniken analysiert. Um Überleben und Reifung der transplantierten Zellen beurteilen zu können, werden verschiedene Marker immunhistochemische und elektronmikroskopische Untersuchungen durchgeführt. Unter den zu analysierenden Markern werden Marker für reife Zapfen (S-L/M-opsin, c-Arrestin,; PNA) und synaptische Verbindungen (PNA, shank1, synaptophysin) sein. Um die Zapfenfunktion und eine Integration in den retinalen Schaltkreis beurteilen zu können, werden elektrophysiologische und sehgerichtete Verhaltenstests durchgeführt. Diese Tests sind nicht invasiv und beinhalten bspw. Elektroretinogramm, opto-kinetisches Trackung und die Light/Dark Box.

Basierend auf den Daten, die aus diesem Projekt hervorgehen, sollen zum einen späteren Zeitpunkt transplantierbare Zapfen-Fotorezeptoren aus humanen pluripotenten Stammzellen generiert und deren Funktionalität im Mausmodell untersucht werden.

Auf dem Gebiet der Fotorezeptorentransplantation gibt es momentan grundsätzlich Fragestellungen, die eine baldige Klärung erfordern: Die meisten bisherigen Studien, die zur Zelltherapie retinaler Degenerationskrankheiten veröffentlicht wurden, nutzen Empfänger mit noch vorhandenen endogenen Fotorezeptoren. Diese Studien legen nahe, dass Spender-Fotorezeptoren nach der subretinalen Transplantation in die Empfängerfotorezeptorschicht migrieren, strutural integrieren und somit das Sehvermögen in Mausmodellen retinaler Degeneration wiederherstellen. Im Gegensatz dazu deuten Daten daraufhin, dass transplantierte Fotorezeptoren sich nicht, bzw. nur in sehr geringer Zahl, strukturell integrieren und zum größten Teil am Ort der Transplantation, d.h. dem subretinalen Spalt, verbleiben. Die Spenderzellen „fusionieren" hier mit endogenen Fotorezeptoren und ermöglichen somit den Austausch von Zytoplasma-Bestandteilen zwischen Spender und Empfänger. Diese Ergebnisse deuten auf einen neuen Mechanismus zur Therapie retinaler Degeneration hin und werden zu einem Paradigmenwechsel auf dem Gebiet der Fotorezeptortransplantationen führen.

 


Technische Universität Darmstadt -

Strahlenbiologie und DNA-Reparatur / Dr. Florian Frohns

Thema: "Etablierung eines transgenen Maus-Modells mit "humanisierten" Stäbchen Photorezeptor-Zellkernen für die mechanistische Analyse humaner Erblindungskrankheiten"

Antragskategorie: Projektförderung
Beginn der Förderung: Juli 2016
Dauer der Förderung: 14 Monate
Höhe der Fördersumme: 12.500€

Zielsetzung und kurze Zusammenfassung des Projekts:

Die Grundlagenforschung zur Aufklärung der Mechanismen humaner Erblindungskrankheiten basiert zum überwiegenden Teil auf der Verwendung von Tieren aus der Klasse der Nagetiere (Mäuse und Ratten). Trotz bedeutender Erkenntnisse durch die Verwendung solcher Modellsysteme, kamen in der Vergangenheit immer wieder Zweifel an der Übertragbarkeit der dabei gewonnen Daten auf den Menschen auf, da es sich hierbei - im Gegensatz zum Menschen - um nachtaktive Tiere handelt. Diese Zweifel wurden durch die Erkenntnis gestützt, dass nachtaktive Tiere eine im Tierreich einzigartige Chromatinorganisation in ihren Stäbchen Photorezeptoren (S-PRs) aufweisen, die in den S-PRs tagaktiver Tiere nicht vorkommt. In einer weiteren Studie wurde nun belegt, dass diese Chromatinorganisation zu drastischen Defekten in der DNA-Reparatur führt. Vor dem Hintergrund, dass viele Studien zur retinalen Degeneration auf der Behandlung von Mäusen und Ratten mit DNA-schädigenden Agenzien (Lichtstress und DNA-alkylierende Agenzien) beruhen, ist dieser DNA-Reparaturdefekt ein klares Argument gegen die Verwendung nachtaktiver Tiere als Modelsystem für solche Studien. Ziel dieses Projekts ist es deshalb, eine transgene Mauslinie (LBR-Mäuse) als Modelsystem zu etablieren, deren S-PRs durch den Knock in eines Lamin Rezeptors eine für humane S-PRs typische Chromatinorganisation aufweisen. Dafür sollen sowohl die Ursachen für die veränderte DNA-Reparatur in den S-PRs nachtaktiver Tiere genauer erforscht, als auch die DNA-Reparatur der S-PRs von Wildtyp- und LBR-Mäusen miteinander verglichen werden. Der Nachweis einer fehlerfreien DNA-Reparatur in den S-PRs von LBR-Mäusen würde einen entscheidenden Schritt in der Etablierung dieses Modelsystems darstellen und könnte somit zu einer verbesserten Erforschung der Mechanismen menschlicher Erblindungskrankheiten beitragen.

 


Universitätsaugenklinik Tübingen / Dr. med. Ditta Zobor & Britta Feldhaus

Thema: „Klinische Charakterisierung von genetisch gesicherten Patienten mit Leber´scher kongenitaler Amaurose (LCA)"

Antragskategorie: Promotionsstipendium
Beginn der Förderung: Mai 2016
Dauer der Förderung: 12 Monate
Höhe der Fördersumme: 15.600 € Personalkosten (12x1.300€); 4.950 € Sachmittel (33x150€)

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Inhalt dieser Arbeit ist die klinische Charakterisierung von Patienten mit Leber'scher kongenitaler Amaurose (LCA), bei denen die genetische Ursache der Erkrankung bereits geklärt ist. Zusätzlich soll bei einer begrenzten Zahl von Patienten, bei denen die verursachenden Mutationen bisher nicht identifiziert werden konnten, eine genetische Untersuchung durchgeführt werden. Die Zielsetzungen sind:

  1. Vollständige und umfassende Erfassung und Übersicht über die Prävalenz der verschiedenen LCA-ene und -Mutationen in der Tübinger LCA-Kohorte (ca. 140 Patienten).
  2. Komplettierung der Kohorte -genetische Analyse bisher nicht untersuchter Fälle (ca. weitere 30 Personen)
  3. Die verschiedenen Phänotypen sollen miteinander verglichen werden und eine ausführliche Phänotyp-Genotyp Korrelation soll beschrieben werden, unter besonderer Berücksichtigung des Multimodal Mapping.

Seit 25 Jahren ist in der Augenklinik Tübingen eine Spezialsprechstunde für Netzhauterkrankungen etabliert. Ziel dieser Spezialsprechstunde ist die Diagnostik und Betreuung der Patienten mit erblichen Netzhauterkrankungen, sowie die systematische Untersuchung und Erfassung funktioneller Parameter für eine Korrelation mit den verschiedenen, den Erkrankungen zu Grunde liegenden Ursachen. In Deutschland leben schätzungsweise 2.000 Patienten mit LCA, von denen sich viele im Laufe der Jahre in Tübingen vorgestellt haben. Die klinische und genetische Charakterisierung einer der größten deutschen LCA-Kohorten ist höchst relevant, da die ersten experimentellen Therapieansätze für diese Erkrankung zum Greifen nah liegen.

Das Projekt soll im Rahmen einer Promotionsarbeit durchgeführt werden.

 


Universität Tübingen - Forschungsinstitut für Augenheilkunde / Prof. Dr. Marius Ueffing

Thema: "Identifizierung therapeutischer Zielstrukturen für Proteinfaltungserkrankungen im Auge"

Antragskategorie: Projektförderung
Beginn der Förderung: 01.01.2016
Dauer der Förderung: 24 Monate
Höhe der Fördersumme: 49.100 €

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Wir haben kürzlich in verschiedenen Tiermodellen gezeigt, dass bei erblichen Netzhauterkrankungen ein gemeinsamer, nicht-apoptotischer Zelltod-Signalweg den Zelltod von Photorezeptoren steuert (Arango-Gonzalez et al., 2014). Darüberhinaus wissen wir, dass Photorezeptoren in der Netzhaut besonders anfällig sind für Störungen im Gleichgewicht der Proteine weil jeden Tag von Neuem grosse Mengen an Sehfarbstoff hergestellt werden. Weil ein funktionierendes Gleichgewicht der Proteine davon abhängt, dass eine Balance geschaffen wird zwischen der Faltung von Proteinen, dem Aufbau von Proteinkomplexen und dem Abbau von Proteinen, untersuchen wir im Fall der  Netzhautdegeneration wie der Mechanismus des Zelltods der Photorezeptoren mit den Veränderungen in der Faltung und Sortierung von Proteinen verbunden ist. Dafür setzen wir Tiermodelle ein, die Mutationen in Proteinen der Photorezeptoren tragen. Das Projekt zielt darauf ab, therapeutische Zielstrukturen in regulatorischen Netzwerken für Proteinhomöostase und  Stressantwort zu finden.  Darauf aufbauend, wollen wir dann zielgerichtet Wirkstoffe entwickeln, die in Zukunft eine pharmakologische Behandlung von Netzhautdegeneration möglich machen sollen.

 


Universitätsklinikum Aachen - Experimentelle Ophthalmologie / Dr. Sandra Johnen - Sabine Diarra

Thema: "Pharmakologische Modulation von Ganglienzellaktivität nach elektrischer Stimulation im Tiermodell der Retinitis Pigmentosa"

Antragskategorie: Projektförderung
Beginn der Förderung: 01.08.15
Dauer der Förderung: 24 Monate
Höhe der Fördersumme: 44.000 €
Personalkosten für eine Medizinisch‐Technische Assistentin

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Im Mausmodell einer langsamen Photorezeptordegeneration wird nach Substanzen gesucht, die durch pharmakologische Modulation von Ganglienzellantworten nach elektrischer Stimulation die Effizienz dieser Behandlungsmethode beim Patienten verbessern können.

Der Degenerationsprozess der Retinitis Pigmentosa (RP) mit dem Verlust der äußeren Körnerschicht führt zu einer Reorganisation der Netzhaut, mit Synaptogenese und einer Diversität der retinalen Glutamatrezeptorverteilung. Die Retinalen Ganglienzellen (RGZ) persistieren bei modifizierter Konvergenz der übrigen Neuronen weitestgehend unbeeinträchtigt. Die rd10 Maus stellt ein geeignetes Tiermodell zur humanen RP dar. Ex‐vivo Analysen der rd10 Netzhaut zeigen im fortgeschrittenen Degenerationsstadium eine oszillierende RGZ Spontanaktivität. Diese Spontanaktivität scheint eine elektrische Stimulation der inneren Netzhaut zu erschweren.

Im Zuge einer beabsichtigten Sensitivitätssteigerung der verbliebenen RGZ sollen in Perfusionsexperimenten die Oszillations‐induzierenden Struktureinheiten durch geeignete Blocker moduliert werden.

Das Ziel des Projekts ist es, das Spektrum der RGZ Signalmodulatoren zu erweitern. Dabei ist der Fokus auf körpereigene Verbindungen im Vergleich zu Substanzen mit etabliertem okulärem Wirkspektrum gerichtet, die zusätzlich über ein neuroprotektives Potential verfügen.

Unter Verwendung eines standardisierten Nachweissystems werden die Testverbindungen ex‐vivo an perfundierten rd10 Netzhautexplantaten in einer Effizienzanalyse auf ihren regulierenden Einfluss auf das Spontanaktivitätsprofil sowie das Antwortmuster nach elektrischer oder lichtinduzierter Stimulation untersucht.

 


Universität Tübingen - Forschungsinstitut für Augenheilkunde / Prof. Dr. Bernd Wissinger & Julia Stolz

Thema: "Aufklärung der Rolle von ATF6 für die Entwicklung und Funktion von Zapfen- und Stäbchen-Photorezeptoren in der Retina"

Antragskategorie: Promotionsstipendium
Beginn der Förderung:01.07.2015
Dauer der Förderung: 24 Monate (optional 36 Monate)
Höhe der Fördersumme: 31.200 € (optional 46.800 €)

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Es konnten kürzlich Mutationen im ATF6-Gen als eine Ursache der autosomal rezessiv vererbten Achromatopsie beim Menschen identifiziert werden. Die Achromatopsie ist eine kongenitale, im Wesentlichen stationär verlaufende Erkrankung, deren Symptome (Farbenblindheit, reduzierte Sehschärfe und Photophobie) sich aus dem kompletten Verlust der Zapfenfunktion erklärt.

Alle bisher mit Achromatopsie assoziierten Gene kodieren für essentielle Funktionselemente der Phototransduktionskaskade im Zapfen-Photorezeptor. Im Gegensatz dazu hat ATF6 keine, zumindest bislang keine bekannte, spezifische oder exklusive Funktion in der Phototransduktion. Es kodiert für den ubiquitär exprimierten Aktivierenden Trankriptionsfaktor 6, der eine Schlüsselfunktion bei der Regulation der Unfolded Protein Response (UPR) und der zellulären Homöostase des Endo-plasmatischen Retikulums (ER) spielt.

Das vorgelegte Projekt soll dazu beitragen, diesen überraschenden Zusammenhang, wie und warum dieses ubiquitär exprimierte Gen und im Falle einer Mutation einen exklusiven retinalen Phänotyp verursacht, zu verstehen. Dazu sollen die bisherigen, noch lückenhaften Untersuchungen des Atf6-knockout Mausmodells vertieft, und zusätzlich atf6-Mutanten beim Zebrafisch als einem zapfendominierten Tiermodell bezüglich visueller Funktion und retinaler Morphologie studiert werden. Zusätzlich sollen Antikörper bzw. Affimere für die (Immun-)Detektion von ATF6 in verschiedenen Spezies validiert und in einer Pilotstudie die Expression dieses Proteins in der Netzhaut während der Entwicklung untersucht werden.

Und schließlich soll in einem zellbiologisch-biochemischen Versuchsansatz die funktionelle Bedeutung einer in der Patientenstudie identifizierten missense-Mutation hinsichtlich der Ausbildung von Homodimeren von ATF6 bzw. Heterodimeren mit ATF6B und BiP charakterisiert werden.

 


Universität Regensburg - Institut für Humananatomie & Embryologie / PD Dr. Dr. Barbara Braunger & Sabrina Schmidt

Thema: "Analyse der neuroprotektiven Aktivität von Endothelen 2 in der Netzhaut"

Antragskategorie: Promotionsstipendium
Beginn der Förderung: Februar 2015
Dauer der Förderung: 3 Jahre
Höhe Fördersumme: 46.800 €

 


TU Dresden - Forschungszentrum für Regenerative Therapien und biologisches Zentrum

Prof. Dr. Marius Ader

Thema: „Analyse und Modulation der Empfängerantwort zur Zellersatztherapie im Auge“

Antragskategorie:
Beginn der Förderung: November 2014
Dauer der Förderung: zwei Jahre
Höhe der Fördersumme: 40.000€

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Sehbehinderung und Blindheit durch den Verlust von Photorezeptorzellen, wie es bei Netzhautkrankheiten wie AMD oder RP beobachtet wird, stellt eine der Hauptgründe für Behinderung in Industrieländern dar. Zell-basierte Strategien, die darauf abzielen, verlorene Photorezeptoren zu ersetzen, werden derzeit entwickelt, um die Funktion degenerierender Netzhäute zu retten.

Mehrere vorklinische Studien deuten darauf hin, dass transplantierte Photorezeptoren sich korrekt in das Wirtsgewebe integrieren und Außensegmente und synaptische Verbindungen bilden, wodurch eine visuelle Funktion in Mausmodellen mit Netzhautdegeneration wiederhergestellt werden konnte. Allerdings ist die Anzahl Reporter-markierter Photorezeptoren innerhalb des Netzhautgewebes noch gering, was der Grund für bislang nur geringe funktionelle Verbesserungen sein könnte.

Das ursprüngliche Ziel des Projektes war es, eine globale Transkriptomanalyse des Wirtsgewebes (Retina und Retinales-Pigment-Epithel (RPE) / Choroid) mit Hilfe der Deep-Sequencing Technologie durchzuführen, um spezifischer Targets, die das Überleben und die Integration von transplantierten Photorezeptoren beeinflussen, zu identifizieren.

In Zusammenarbeit mit Dr. Andreas Dahl aus der Deep Sequencing Facility des CRTD generierten wir RNAseq Daten zu verschiedenen Zeitpunkten nach subretinaler Injektion in Mäuse, welche zeigten, dass ca. 10% der Gene nach Transplantation innerhalb des Empfängergewebes differentiell exprimiert sind. Diese Datensätze werden derzeit weiter analysiert, um potenzielle Ziele für eine Modulation zu identifizieren, die einen verbesserten Transplantationserfolg ermöglichen.

Während des Projektes erstellte unser Labor jedoch Daten, die zu einem Paradigmenwechsel im Bereich der Netzhauttransplantation führten: Im Gegensatz zu der vorherigen Annahme, dass Spender-Photorezeptoren sich strukturell in das Wirts-Netzhautgewebe integrieren, konnten wir zeigen, dass die Spenderzellen in Wirklichkeit zytoplasmatisches Material mit endogenen Photorezeptoren austauschen. Aufgrund der Bedeutung dieser Ergebnisse konzentrierten sich die Experimente innerhalb der Arbeitsgruppe auf diese neuartige Beobachtung, was zur prominenten Veröffentlichung der Originalarbeitg (Santos-Ferreira et al., Nat Commun, 2016) sowie einem Übersichtsartikel mit dieser konzeptionellen Veränderung führte (Santos-Ferreira et al., 2017). Diese Erkenntnisse erfordern eine Neuinterpretation zellbasierter Strategien zur Behandlung von retinalen degenerativen Erkrankungen, die durch dysfunktionelle aber noch vorhandene Photorezeptoren charakterisiert sind, und von einer therapeutischen Unterstützung durch Spenderzellen profitieren könnten (Unterstützungs-Zelltherapie). Umgekehrt muss eine Netzhaut-Degeneration, die durch einen vollständigen Verlust von Photorezeptoren charakterisiert ist, als Hauptziel für Photorezeptor-Ersatzansätze (Zellersatztherapie) betrachtet werden. Angesichts dieser Erkenntnisse muss eine weitere Ebene für die Bewertung der gewonnenen Daten zur Wirtsreaktion auf subretinale Injektionen in Betracht gezogen werden: Wie beeinflusst die Wirtsumgebung einen Materialtransfer zwischen Spender-und Empfänger-Photorezeptoren und wie beeinflusst sie Konnektivität und Funktion bei Photorezeptor Ersatzansätzen? Wir werden daher den Einfluss des Empfängergewebes nach subretinaler Transplantation in Bezug auf diese beiden potentiellen therapeutischen Ansätze weiter untersuchen. Die erzeugten Daten sind daher von größter Bedeutung für eine zielgerichtete Modulation der Empfänger-Umgebung in Bezug auf Zellunterstützung bzw. Zellersatz mit dem ultimativen Ziel einer Wiederherstellung von visuellen Funktionen.

 

 


 

Universitätsklinikum Regensburg - Institut für Humangenetik / Prof. Dr. Bernhard H. F. Weber & Sibylle Rosendahl

Thema: "IPS-Zellen-Etablierung einer IPSC-abgeleiteten RPE Zellkulturbank..."

Antragskategorie: Promotionsstipendium
Beginn der Förderung: Februar 2014
Dauer der Förderung: 3 Jahre
Höhe der Fördersumme: 46.800 €

 


TU Dresden - DFG-Forschungszentrum für Regenerative Therapien
Prof. Dr. rer. nat. habil. M.A.Michael Brand

Thema: "Übertragung der Fähigkeit zur Retinaregeneration vom Zebrafisch in Säugetiere"

Beginn: 1. Juli 2014
Dauer der Förderung: zwei Jahre
Höhe der Fördersumme: 25.000 €

Kurze Zusammenfassung des Projekts:

Hintergrund
Die Retina von Fischen ist der menschlichen Retina in Struktur und Funktion sehr ähnlich, verfügt jedoch, im Gegensatz zur Retina der Säuger inkl. des Menschen, über eine extrem eindrucksvolle und interessante Fähigkeit zur Regeneration nach Läsion oder Verlust von neuronalen Zelltypen, inklusive der Photorezeptoren.

Wir untersuchen die Fähigkeit zur Regeneration am Zebrafisch (Zebrabärbling, Danio rerio), in dem sehr gut entwickelte zelluläre, molekulare und genomische Methoden erlauben, diesen Prozess im Detail zu untersuchen, und wollen die im Fisch identifizierten Mechanismen auf ihre Konservierung und mögliche perspektivische Reaktivierung in Säugern hin untersuchen.

Die adulte Zebrafisch Retina enthält zwei verschiedene Stammzellnischen, über die die Retina wachsen bzw. regenerieren kann: die Ciliary marginal zone (CMZ) bewirkt das Größenwachstum im Randbereich der Retina, während im weit überwiegenden, zentralen Teil der Retina das Wachstum über Müller Glia Zellen (MGCs) bewerkstelligt wird, die als Stammzellen wirken. In der unverletzten Retina teilen sich MGCs sehr langsam, und generieren, nach bisherigem Kenntnisstand, lediglich Photorezeptoren des Stäbchen-Typs.

Nach unseren noch unveröffentlichten Ergebnissen können sie mglw. jedoch auch die übrigen Zelltypen der Retina generieren. Dies wäre mit den Erkenntnissen aus Regenerationsexperimenten konsistent, denn nach Verletzung können MGCs alle fehlenden Zelltypen wieder ersetzen. Nach einer Läsion, z.B. durch Stark-Licht oder durch Ouabain-induzierte Excitotoxizität, können MGCs dedifferenzieren und wieder in den Zellzyklus eintreten, um dann einen Cluster von proliferierenden Vorläuferzellen hervorzubringen, die dann ihrerseits zu den fehlenden Retina Zelltypen differenzieren können.

Im Projekt ‘RetinoReg’ war unser Ziel, Mechanismen der erfolgreichen Retina Regeneration im Zebrafisch zu identifizieren, im Hinblick auf eine mögliche Translation der Erkenntnisse für die Säuger Retina, und damit für mögliche künftige Behandlung von retinalen Erkrankungen. Unser Ziel war hierbei ein Genom-weiter Vergleich der Regenerations-kompetenten MGCs im Zebrafisch relativ zu nicht regenerierenden Kontrollen, und mit nicht-kompetenten MGCs in der Maus, um Mechanismen zu identifizieren die Regeneration erlauben bzw. verhindern.

Die spezifischen Fragestellungen unseres Arbeitsprogramms waren:

I.                    Wie verändert sich das Transkriptom der Müller Glia Zellen im Zebrafisch, und lassen sich Unterschiede definieren zwischen Zebrafisch und Maus ?

II.                  II. Welche Vorläuferzellpopulationen werden während der Regeneration der Zebrafisch Retina gebildet ?
Die beiden Projektziele konnten erfüllt werden. Eine dritte, ursprünglich im Projekt geplante Fragestellung konnte aus finanziellen Gründen nicht realisiert werden.

(I)                 Transkriptom Analyse von Zebrafisch Müller Glia Zellen in der Regeneration.
Um neue regulatorische Gene und Signalwege im Transkriptom der regenerierenden Fischretina zu identifizieren haben wir einen Zeitverlauf des Transkriptoms von MGCs nach Läsion zu verschiedenen Zeitpunkten durch 'deep sequencing' der MGC aufgenommen, und die resultierenden Daten bioinformatisch weiter untersucht. Zunächst haben wir ein Licht-Ablationsmodell entwickelt, das Schädigungen

der Retina ohne Induktion einer offenen Verwundung erlaubt, ähnlich zur Situation in menschlichen retinalen Erkrankungen wie Retinitis pigmentosa oder Leber’s congenital amaurosis. Sodann haben wir neue, transgene Reporter Linien hergestellt, die rot fluoreszentes mcherry Protein mit einem Kernlokalisationssignal spezifisch in Müller Glia Zellen und ihren Tochterzellen exprimieren. In Kombination mit einer von uns bereits früher generierten transgenen PCNA-GFP Linie konnten wir so MGCs, die durch den Photorezeptor-Defekt nach Licht-Läsion zur Proliferation angeregt wurden, spezifisch mit Hilfe der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) isolieren. Ausserdem konnten wir so zum Vergleich MGC Populationen gewinnen, die nicht zur Teilung angeregt waren, sowie nicht-MGC Populationen. Die resultierenden mRNA Populationen wurden von uns zur Genom-weiten Sequenzierung mit Hilfe eines Illumina HiSeq Sequenzierers aufbereitet, und die Resultate mit Bioinformatik Methoden analysiert.

Wir konnten eine große Anzahl von veränderten Prozessen in den MGCs nachweisen, darunter die Produktion von Zytokinen und Zellzyklusregulatoren, wie auch die Aktivierung bekannter Signalwege wie PI3/Akt die bereits bekannt waren. Wir konnten ebenfalls weniger

bekannte bzw. unbekannte Mechanismen definieren, wie Adhäsions-abhängige Signalprozesse, Immunmodulation und Oxidative Stress Antworten. Dieser neue Datensatz eignet sich hervorragend zum Vergleich mit publizierten und nicht-publizierten Datensätzen zu MGC Transkriptomen in der Maus. Vielversprechende Gen-Kandidaten sind von uns zur weiteren Funktionsanalyse in vivo ausgewählt worden, und werden bspw. durch Herstellung von Crispr/Cas9 vermittelten Gen knock-out Studien im Zebrafisch von uns derzeit näher untersucht.

(II) Bildung von Vorläuferzellpopulationen und Analyse der Zellschicksale.
Hier untersuchen wir, wie sich der Pool von MGC abgeleiteten Vorläuferzellen auf spezifische Zellschicksale für Ganglion Zellen, Amakrine Zellen und Photorezeptoren aufteilt. Hierzu nutzen wir die von uns entwickelte Licht-Läsion für Photorezeptoren (Weber et al., 2013), sowie Ouabain-induzierte Exzitotoxizität für andere retinale Neurone. Zur Identifikation der retinalen Subtypen nutzen wir das von uns für den Zebrafisch adaptierte konditionale CreERT2-loxP System, unter Einsatz einer Reihe von neuen transgenen Linien, die spezifisch in MGCs und anderen retinalen Zellpopulationen exprimiert sind, und uns so gezielte Auslösung der Zellmarkierung erlauben. Wir konnten die Markierungen erfolgreich durchführen, und die entstehenden Tochterzellen beobachten. Beispielsweise konnten wir am Tag 7 nach Läsion Zellen beobachten, die das Transgen GFP unter einem spezifischen Promotor für Photorezeptoren exprimieren (Tg(atoh7:GFP)) und spezifisch in der Photorezeptor Schicht akkumulierten.
In derzeit laufenden, weiteren quantitativen Studien ermitteln wir, welche Zelltypen zu verschiedenen Stadien der Regeneration entstehen.


 


Universität Nijmegen - Institut für Humangenetik / Prof. Dr. Fans Cremers

Thema: "Registration of inherited retinal disease-assosiated DNA sequenz variants in LOVD's"

Antragskategorie: Kleinprojekt
Beginn der Förderung: 18.06.2013
Dauer der Förderung: 3 Jahre
Höhe der Fördersumme: 5.000 €

 


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